Study: SARS-CoV-2 Virus-like Particles Produced by a Single Recombinant Baculovirus Generate Anti-S Antibody and Protect against Variant Challenge. Image Credit: creativeneko/Shutterstock

Die Erzeugung von SARS-CoV-2 virusähnlichen Partikeln in Insektenzellen

Die rasche Ausbreitung des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), die zur COVID-19-Pandemie führte, hat die Welt dazu veranlasst, überstürzte, aber wirksame Impfstoffe gegen die Krankheit zu entwickeln. Die meisten derzeit eingesetzten COVID-19-Impfstoffe beruhen auf dem Prinzip der Virusinaktivierung, adenoviraler Vektoren oder der Verwendung direkter Nukleinsäuren (mRNA/DNA).

Lernen: SARS-CoV-2 virusähnliche Partikel, die von einem einzelnen rekombinanten Baculovirus produziert werden, erzeugen Anti-S-Antikörper und schützen vor Varianten-Challenge. Bildnachweis: creativeneko/Shutterstock

In einer neuen Studie, die kürzlich in der Zeitschrift veröffentlicht wurde Virenhaben Forscher über die Entwicklung eines vielversprechenden COVID-19-Impfstoffkandidaten berichtet, der auf SARS-CoV-2 virusähnlichen Partikeln (VLPs) basiert, die aus der Co-Expression von Spike (S), Membran (M) und Hülle stammen (E) Strukturproteine ​​im Baculovirus-Expressionssystem.

In vitro Tests bestätigten ihre Antigenität, und eine virale Herausforderung in VLP-immunisierten Hamstern zeigte ihre Immunogenität. Die Immunisierung mit den SARS-CoV-2-VLPs konnte die In-vivo-Replikation des Herausforderungsvirus nicht verhindern; die viralen Titer und Krankheitspathologiemarker waren jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe reduziert.

Die virusähnlichen Partikel (VLPs)

VLPs entsprechen Strukturen, die dem Virus ähnlich sind; sie sind jedoch aufgrund des Fehlens von genomischer DNA oder RNA replikationsdefizient. Ein VLP kann man sich auch als leere Virenhülle vorstellen. Diese können direkt mit interagieren Antigen-präsentierende Zellen (APCs), insbesondere die dendritischen Zellen, die die stärksten APCs sind.

Coronavirale M‐ und E‐Proteine, falls coexprimiert in vitro, kann zur Bildung von VLPs führen. Das membranüberspannende Protein-M, das am häufigsten vorkommende Protein, das mit der Coronavirus-Hülle assoziiert ist, treibt in erster Linie den Zusammenbau von Coronavirus-Partikeln an. Während M oligomerisiert, um ein Gitter zu bilden, das die Konformation der Virushülle strukturiert, rekrutiert es auch andere Strukturproteine ​​in die entstehenden Viruspartikel, die den Zusammenbauprozess vervollständigen. Das kleinere Hüll-E-Protein ist, obwohl es in sehr geringer Menge in die entstehenden Virionen eingebaut wird, für eine erfolgreiche Virusknospung unverzichtbar.

Das trimere Spike-S-Protein, das für die Wechselwirkung mit dem Wirtsrezeptor ACE2 verantwortlich ist und die Membranfusion erleichtert, kann auch in den M und E exprimierenden Zellen coexprimiert werden. S ist ein hochimmunogenes Antigen, das die Bildung von neutralisierende Antikörperwodurch die Interaktion zwischen S1 und ACE2 blockiert wird.

Da die VLPs die authentische Virusstruktur nachahmen und trimeres S-Protein an mehreren Stellen exprimieren, stimulieren sie in geeigneter Weise die humorale Immunität und können von den Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) erkannt werden, um eine geeignete T-Zell-Antwort zu erzeugen. Außerdem ist die gleichzeitige Verabreichung eines Adjuvans aufgrund ihrer multimeren Natur nicht erforderlich.

Mehrere VLP-basierte Impfstoffe für andere Viren, die vom Baculovirus-Insektenzellsystem produziert werden, sind derzeit im Einsatz und belegen die Skalierbarkeit und Akzeptanz“, hebt das Team hervor.

SARS-CoV-2 VLP Konstruktion und Verifizierung

Das Team hatte in der Vergangenheit ein rekombinantes Baculovirus konstruiert, das S-, E- und M-Strukturproteine ​​exprimierte, die für die SARS-CoV-VLP-Bildung erforderlich sind. Nach einer ähnlichen Strategie entwickelte das Team in der aktuellen Studie ein einzelnes rekombinantes Baculovirus, das SARS-CoV-2 S, M und das zuvor verwendete SARS-CoV-E-Protein exprimiert. Die E-Proteine ​​von SARS-CoV und SARS-CoV-2 sind für die Zwecke der VLP-Produktion funktionell austauschbar. Daher verwendete das Team das vorhandene SARS-CoV-E-Geninsert für die neue rekombinante Viruskonstruktion.

Western-Blotting von Insektenzellen, die mit dem rekombinanten Virus (kompetente VLP-Konstruktion) infiziert waren, bestätigte die gemeinsame Expression von sowohl S- als auch M-Proteinen. Auch wurde gezeigt, dass das S-Protein als trimeres Protein (die native Form auf der viralen Hülle) in der VLP-Struktur existiert. VLPs wurden auf einem Saccharosegradienten gereinigt, wo sie bei einem Saccharosegradienten von 35 % eine deutliche Bande bilden. Mit Coomassie-Blau gefärbtes SDS-PAGE auf der 35 %-Gradientenfraktion zeigte 3 auffällige Banden bei 10, 30 und 180 kDa, die E-, M- bzw. S-Proteinen entsprachen.

Daher produzierte das Team erfolgreich ein einzelnes rekombinantes Baculovirus, das allein die drei Strukturproteine ​​exprimieren konnte, die für die VLP-Bildung von SARS-CoV-2 erforderlich sind.

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) der Fraktion zeigte VLPs, die als vesikelartige Strukturen mit einem Durchmesser von ~100 nm zusammengesetzt waren und kronenartige Spitzen aufwiesen, die für Coronavirus-Partikel charakteristisch sind.

SARS-CoV-2-VLPs sind sowohl antigen als auch immunogen

Genesende Seren wurden verwendet, um die VLPs auf Antigenität zu sondieren. Mehrere Rekonvaleszenzseren reagierten stark mit den immobilisierten VLPs im ELISA, was darauf hindeutet, dass VLPs S-Antigen in einer Form präsentierten, die geeignet ist, die Antikörper zu binden.

Ein Syrischer-Hamster-Modell, das eine Krankheitspathologie und eine neutralisierende Antikörperreaktion ähnlich dem menschlichen COVID-19 aufweist, wurde verwendet, um die Immunogenität der VLPs zu testen, die das SARS-CoV-2-S-Protein tragen. Die VLP-Kandidatenimpfung wurde in zwei Dosen im Abstand von 28 Tagen an 5 Hamster verabreicht. Es wurden auch keine Behandlungskontrollen geführt.

Serokonversion und die Entwicklung von neutralisierenden Antikörpern gegen RBD wurden bei 4 von 5 Tieren nach der ersten Dosis und bei allen VLP-immunisierten Tieren nach der zweiten Dosis beobachtet. Die Kontrollgruppe zeigte keine Antikörperaktivität.

Später, zwei Wochen nach der zweiten VLP-Dosis, wurden die Hamster experimentell mit einer infektiösen Dosis des SARS-CoV-2 infiziert und die Antikörperaktivität beobachtet. Die Titer neutralisierender Antikörper stiegen innerhalb von 4 Tagen nach der Herausforderung bei den mit VLP immunisierten Tieren früher als bei der Kontrollgruppe.

Das Team beobachtete auch eine langsamere Clearance genomischer RNA aus den oralen Abstrichen der Kontrollen im Vergleich zu der VLP-immunisierten Gruppe. Die maximale Viruslast am Tag 2 der Belastung in den oralen Abstrichen der Behandlungsgruppe war viel niedriger als in der Kontrollgruppe, nämlich 1,4 × 107 und 4,7 × 107, bzw. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant. Auch Nasenabstriche zeigten ein ähnliches Muster.

Am Tag 10 zeigten die Lungen von VLP-immunisierten Tieren niedrigere Werte für die Entzündungsmarker und weniger S-positive Synzytialzellen als die nicht geimpften Kontrollen.

Alle Behandlungs- und Kontrolltiere erholten sich am Tag 14 nach der Virusbelastung, aber die immunisierten Tiere erholten sich signifikant schneller als die Kontrollen.

Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Antikörperspiegel nicht ausreichten, um vor einer Infektion zu schützen, aber ausreichten, um die Schwere der Erkrankung zu verringern.

In unserer Studie waren VLPs in Abwesenheit von Adjuvans immunogen und wurden mit einer Technologie hergestellt, die bereits für Human- und Tierimpfstoffe verwendet wird und Skalierbarkeit, einen akzeptablen Herstellungsprozess und einen etablierten Weg zur Zulassung bietet“, schließt das Team.

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